En savoir plus

Détermination in vivo des paramètres enzymatiques dans une voie métabolique synthétique

Les principes de l’enzymologie sont basés sur des essais enzymatiques réalisés in vitro avec des enzymes pures et diluées dans des tampons définis. Cette approche a produit une grande quantité de données sur des milliers d'enzymes et a permis d'énormes progrès dans la compréhension des mécanismes enzymatiques. Cependant les conditions in vitro sont peu représentatives de l'environnement réel des enzymes à l'intérieur des cellules. Le milieu cellulaire est décrit comme un gel hétérogène organisé, dense, saturé de macromolécules et d’organites cellulaires lipidiques qui peuvent donner lieu à des effets de partitionnements et de changement dans la diffusion des molécules. Par conséquent, les paramètres enzymatiques déterminés in vitro ne sont probablement pas équivalents à ceux mesurés in vivo. Bien que des progrès dans la compréhension du rôle de la viscosité et de la saturation en macromolécules sur les paramètres enzymatiques aient été réalisés, les mesurer in vivo reste un défi. Le projet ENZINVIVO combinera des techniques de pointe en enzymologie, biologie de synthèse, biologie des systèmes et modélisation théorique afin de construire un environnement cellulaire permettant de reproduire graduellement les variations de concentration en enzyme et en substrat, construisant ainsi in vivo la configuration expérimentale classiquement utilisée en enzymologie. Pour valider notre approche, nous utiliserons comme modèle enzymatique deux isoformes de la phytoène synthase (voie de biosynthèse des caroténoïdes), ayant deux comportements cinétiques in vitro différents. La voie de biosynthèse des caroténoïdes peut être reconstituée dans des micro-organismes modèles tels que la levure, ce qui permettra l'utilisation d'outils de génie génétique et l’accès à des techniques omiques. La phytoène synthase est l'enzyme clé de la voie des caroténoïdes : elle réalise la conversion du précurseur naturel soluble (GGPP) en une molécule lipophile, le phytoène, premier caroténoïde de la voie. Cette enzyme est donc un bon modèle pour étudier une étape enzymatique complexe dans laquelle l'ultrastructure cellulaire est probablement importante.

Ce projet construira une série d’expériences de complexité croissante en combinant des analyses in vitro, in vivo et in silico. Les expériences in vitro seront effectuées dans des conditions mimant partiellement la complexité cellulaire (viscosité, saturation par des macromolécules et présence de structures cellulaires partielles).

Grâce aux outils de l’ingénierie génétique et métabolique, nous construirons des souches de levure ayant:

• (1) des concentrations définies et variables de GGPP (variation de la concentration du substrat)
• (2) des quantités variables de phytoène synthase (variation de la concentration en enzyme)
• (3) absence ou présence du reste de la voie enzymatique (déplacement de l’équilibre thermodynamique). Les expériences in vivo seront réalisées en utilisant les techniques les plus avancées de la biologie des systèmes (chémostats parallélisés, régulation rapide des gènes, marquage ¹³C, métabolomique, fluxomique et analyses mathématiques/statistiques).

Les résultats de notre projet, bien que déterminés sur un seul type de réaction enzymatique, valideront la généricité de la méthodologie. Nous démontrerons que la biologie de synthèse et le génie génétique peuvent promouvoir de nouveaux développements en enzymologie et proposer de nouveaux concepts pour étudier la complexité des réactions enzymatiques dans la cellule. En outre, notre approche permettra de déterminer les concentrations cellulaires optimales de substrat et d’enzyme permettant d’atteindre l'efficacité maximale de la réaction en accord avec une bonne homéostasie entre voies synthétiques et naturelles. Ces outils d'ingénierie métabolique seront utiles pour la communauté scientifique afin améliorer la production, par des microorganismes, des molécules naturelles et synthétiques.

Coordonnateur du projet : Gilles Truan (INSA Toulouse , LISBP)

Financement ANR 2017-2020

Contact UMR SPO :Virginie Galeote, Carole Camarasa, Thibault Nidelet

Partenaires:

INSA Toulouse LISBP/I2M (GillesTruan)

INSA Toulouse LISBP/METASYS (J-C Portais)

Laboratoire Interdisciplinaire de Physique Grenoble LIPhy/BIOP (J. Geiselmann)

Plus d'infos sur le site de l'ANR